L'Underwater Theme accompagne Mario dans les trois sections aquatiques de Super Mario Bros. : World 2-2, World 7-2, et la section sous-marine de World 8-4. Ces niveaux marquent un changement radical de gameplay où Mario nage au lieu de courir, affrontant des Bloopers et des Cheep-Cheeps dans des environnements remplis de coraux. La musique souligne parfaitement cette transition en passant d'un rythme énergique à une valse gracieuse et apaisante qui évoque le mouvement fluide de la nage.

Koji Kondo a officiellement déclaré que l'Underwater Theme fut la première composition qu'il a terminée pour Super Mario Bros., car il était facile d'imaginer ce que devait être l'atmosphère sous-marine. Cette facilité de conception contraste avec le Ground Theme qui lui a demandé le plus de temps et d'efforts. Le thème est écrit en do majeur avec une signature rythmique en 3/4 caractéristique de la valse, jouée à un tempo rapide de 226 BPM. Cette structure en valse évoque les mouvements ondulants de l'eau et donne une sensation d'élégance flottante.

L'Underwater Theme est devenu un élément récurrent de la franchise, servant souvent de musique d'écran-titre dans les remakes et portages. Super Mario Bros. 2 (1988) a inauguré cette tradition en utilisant un arrangement comme thème de titre, suivi par Super Mario All-Stars (1993) et toute la série Super Mario Advance (2001-2003). Le thème apparaît également dans Luigi's Mansion (2001) où Melody Pianissima le joue au piano et demande à Luigi ce que le compositeur avait en tête — la réponse correcte étant "l'eau". Dans Paper Mario: The Thousand-Year Door (2004), Peach peut même fredonner les premières notes sous la douche.